LEISHMANIA AMAZONENSIS-GFP, AVALIAÇÃO DO DECAIMENTO DA INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA E ESTRATÉGIAS PARA A SUA SELEÇÃO

Resumo

Recentemente o método de transfecção gênica da Green Fluorescent Protein (GFP) usado em Leishmania tem facilitado o monitoramento de ensaios in vitro e in vivo para a avaliação de fármacos leishmanicidas. Os parasitas transfectados, entretanto expressam de forma heterogenia o gene GFP e o plasmidio é perdido na ausência de pressão seletiva ao marcador de resistência. Com a perda da intensidade de fluorescência torna-se necessária a seleção dos parasitas fluorescentes utilizando o antibiótico geneticina. Até o presente não há relatos sobre a investigação do decaimento da intensidade de fluorescência dos parasitas-GFP e os métodos de seleção são destinados as formas promastigotas e não aos amastigotas, forma encontrada no hospedeiro vertebrado. Os objetivos deste trabalho foram: 1-investigar a dinâmica do decaimento da intensidade de fluorescência de promastigotas de L. amazonensis-GFP durante um período longo (7 meses); 2- avaliar a eficiência dos protocolos de seleção para promastigotas e amastigotas. Os métodos de análise foram a citometria de fluxo e a microscopia de fluorescência. A seleção de promastigotas-GFP (5x105/ml) foi feita com 1mg/ml de geneticina. O acompanhamento por 7 meses da cultura de promastigotas mostrou que 70% dos parasitas não estavam fluorescentes, mas foi possível estabelecer uma seleção eficaz de 80-90% de parasitas-GFP selecionando-os bimensalmente. Os testes com amastigotas-GFP (1x107/ml) isolados da lesão de camundongos Balb/c e cultivados em meio 199 com 1mg/ml de geneticina e o testes in vivo dos amastigotas-GFP após aplicação de 3 a 6 doses de geneticina (40mg/kg) intra-lesão em camundongos Balb/c com 90 dias de infecção, mostraram que a seleção de amastigotas é possível, apesar da eficiência ser baixa (10% a 20% de parasitas fluorescentes). Concluímos que apesar da seleção de promastigotas-GFP ser mais eficaz, é possível o desenvolvimento de testes com amastigotas-GFP. Apoio: FAPESP, CAPES e CNPq.